傳代培養操作步驟：

一、貼壁培養

細胞傳代培養操作步驟如下：

（1）傳代前在倒置顯微鏡下觀(guān)察細胞形態(tài)和生長(cháng)密度，當細胞生長(cháng)密度達到80%~90%時(shí)，即可進(jìn)行傳代。

（2）吸掉或倒掉培養瓶?jì)鹊呐囵B液。加入PBS清洗1~2次，左右輕輕搖晃后棄掉。

（3）根據培養瓶大小向瓶?jì)燃尤脒m量含EDTA的，一般應覆蓋整個(gè)培養瓶底。

（4）把培養瓶放入37℃ CO2培養箱進(jìn)行消化，2~5min后拿出放在倒置顯微鏡下進(jìn)行觀(guān)察，當發(fā)現有70%~80%細胞收縮變圓、細胞間隙變大時(shí)，再輕輕拍打培養瓶使剩余細胞脫落，然后立即加入2倍量的培養液中止消化，使用吸頭輕輕吹打，混合均勻，以防消化過(guò)度。

（5）吸出所有細胞懸液至離心管內，1000rpm/min離心3~5min。

（6）棄上清，加入適量培養液重懸細胞，輕輕吹打混勻，使細胞均勻分散。

（7）用吸頭吸取適量細胞懸液，以適宜的密度接種于新的培養瓶中，補足培養液，搖勻，放置于37℃ CO2培養箱中進(jìn)行培養。

（8）根據細胞生長(cháng)狀態(tài)確定換液或傳代時(shí)間，甚至進(jìn)行細胞凍存。

人乳腺癌成纖維細胞永生化

細胞基本屬性：

細胞詳細介紹：

二、懸浮細胞

傳代培養操作步驟如下：

一般實(shí)驗室中懸浮細胞傳代方法分為直接傳代法和離心傳代法（培養液中含有細胞碎片的情況下）。當在顯微鏡下觀(guān)察到懸浮細胞已經(jīng)長(cháng)滿(mǎn)至80%~90%（細胞懸液變黃）時(shí)，即可進(jìn)行傳代。

（1）嚴格進(jìn)行無(wú)菌操作，所用一切試劑及耗材均應無(wú)菌，且須在無(wú)菌超凈工作臺中紫外照射30min以上，以免細胞發(fā)生污染。

（2）所用培養液必須適宜細胞生存和生長(cháng)。來(lái)源于不同動(dòng)物種類(lèi)、組織類(lèi)型的細胞，對培養液的要求不一樣，必要時(shí)可用預實(shí)驗的方法選擇適當的培養液。

（3）胎牛血清對于維持細胞生存，促進(jìn)細胞生長(cháng)起著(zhù)關(guān)鍵作用?？筛鶕墨I或預實(shí)驗選擇合適的胎牛血清。一旦確定，就應保持用至實(shí)驗完成。

（4）消化細胞時(shí)應避免消化時(shí)間過(guò)短導致消化不收集到的細胞數量少，或消化時(shí)間過(guò)長(cháng)導致細胞成團塊樣絮狀游離，這時(shí)的細胞已有損傷或死亡，影響細胞數量和實(shí)驗進(jìn)度。

（5）細胞離心的時(shí)候應避免離心力過(guò)小收集的細胞數量不夠，或離心力過(guò)大對細胞產(chǎn)生損傷。離心后的細胞沉淀棄去上清后，應先彈散細胞沉淀，再加入培養液重懸，這樣比直接吹打對細胞損傷小，可以提高細胞活率。

（6）吹打細胞時(shí)應盡量避免細胞的產(chǎn)生，以免損傷細胞，影響細胞狀態(tài)（吹打過(guò)程中殘留部分液體在吸頭內可以減少氣泡的產(chǎn)生）。

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