PCR反應的特異性決定因素為：
①引物與模板DNA特異正確的結合；
②堿基配對原則；
③Taq DNA聚合酶合成反應的忠實(shí)性；
④靶基因的特異性與保守性。
PCR實(shí)驗方法步驟：
方法
1：在冰浴中，產(chǎn)品僅用于科研按以下次序將各成分加入一無(wú)菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer
5μl dNTP mix （2mM）
4μl 引物1（10pM）
2μl 引物2（10pM）
2μl Taq酶 （2U/μl）
1μl DNA模板（50ng-1μg/μl）
1μl 加ddH2O至 50 μl
視PCR儀有無(wú)熱蓋，不加或添加石蠟油。
2：調整好反應程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執行擴增。一般：在93℃預變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，在72℃ 保7min。
3：伴放線(xiàn)放線(xiàn)桿菌探針?lè )晒舛縋CR試劑盒結束反應，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長(cháng)期保存。
4：PCR的電泳檢測：如在反應管中加有石蠟油，需用100μl進(jìn)行抽提反應混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
注意事項:
1.PCR反應應該在一個(gè)沒(méi)有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行，設立一個(gè)的PCR實(shí)驗室。
2.純化模板所選用的方法對污染的風(fēng)險有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結果，純化的方法越簡(jiǎn)單越好。
3.所有試劑都應該沒(méi)有核酸和核酸酶的污染，產(chǎn)品僅用于科研操作過(guò)程中均應戴手套。
4.PCR試劑配制應使用高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌或高壓滅菌。
5.試劑都應該以大體積配制，試驗一下是否滿(mǎn)意，然后分裝成僅夠一次使用的量?jì)Υ?，從而確保實(shí)驗與實(shí)驗之間的連續性。
6.試劑或樣品準備過(guò)程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應洗滌干凈并高壓滅菌。
7.PCR的樣品應在冰浴上化開(kāi)，并且要充分混勻。
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