技術(shù)文章/ARTICLES

流感病毒N2亞型核酸檢測試劑盒（熒光PCR法）反應流程常規程序:

將PCR反應所需的成分配置完后，在PCR儀上于94-96℃預加熱幾十秒至幾分鐘，使模板DNA充分變性，然后進(jìn)入擴增循環(huán)。在每一個(gè)循環(huán)中，先于94℃保持30秒鐘使模板變性，然后將溫度降到復性溫度（一般50-60℃之間），一般保持30秒鐘，使引物與模板充分退火；在72℃保持1分鐘（擴增1kb片段），使引物在模板上延伸，合成DNA，完成一個(gè)循環(huán)。重復這樣的循環(huán)25～35次，使擴增的DNA片段大量累積。最后，在72℃保持3-7min，使產(chǎn)物延伸完整，4℃保存。

2．復性（退火）和延伸溫度

復性的溫度是PCR擴增是否順利的關(guān)鍵因素，通常在50-60℃之間。具體的溫度主要由引物的Tm值決定。延伸溫度絕大多數設定為72℃。如果復性的溫度很高，可以將延伸溫度和復性溫度設置成同一溫度，變成二步法PCR。

3．反應時(shí)間

變性步驟一般使用30秒鐘，如果模板的G+C含量較高，或直接用細胞做模板，變性時(shí)間可適當延長(cháng)。復性時(shí)間有30秒種一般是足夠的。延伸時(shí)間由擴增產(chǎn)物的大小決定，一般采用1kb用1分鐘來(lái)保證充足的時(shí)間。

4．循環(huán)次數

循環(huán)次數主要與模板的起始數量有關(guān)，在模板拷貝數為104～105數量級時(shí)，循環(huán)數通常為25～35次。

平臺效應（plateaueffect）：PCR擴增過(guò)程后期會(huì )出現的產(chǎn)物的積累按減弱的指數速率增長(cháng)的現象。原因：底物和引物的濃度已經(jīng)降低，dNTP和DNA聚合酶的穩定性或活性降低，產(chǎn)生的焦磷酸會(huì )出現末端產(chǎn)物抑制作用，非特異性產(chǎn)物或引物的二聚體出現非特異性競爭作用，擴增產(chǎn)物自身復性，高濃度擴增產(chǎn)物變性不ce底。

5．PCR反應液的配制

PCR反應體系的配置方式有時(shí)也會(huì )影響反應的正常進(jìn)行。常規方法與其它酶學(xué)反應一樣，在最后加入DNA聚合酶。早期的PCR儀沒(méi)有帶加熱的蓋子，要求在反應液上覆蓋一層礦物油，防止水分蒸發(fā)。

對于使用具3’-5’外切活性的高溫DNA聚合酶時(shí)，有時(shí)會(huì )擴增不出產(chǎn)物。在遇到這個(gè)問(wèn)題時(shí)，如果將反應成分分開(kāi)配制，A管含模板、引物和dNTP，以及調整體積的H2O，B管含緩沖液、DNA聚合酶和水，然后再將兩管溶液混合起來(lái)，可較好地克服這個(gè)問(wèn)題。

無(wú)水磷酸三鈉/三堿式磷酸鈉/原磷酸三鈉/磷酸三鈉/磷酸鈉/Trisodium phosphateAR，98%，500克國產(chǎn)/進(jìn)口

2,2-聯(lián)喹啉-4,4-二羧酸鈉/4,4-二羧基-2,2-聯(lián)喹啉二鈉/2,2-聯(lián)喹啉-4,4-二甲酸二鈉/BCABR，98%5克國產(chǎn)/進(jìn)口

D(-)酒石酸鈉/酒石酸鈉/D-酒石酸鈉/2,3-二羥基丁二酸鈉/D-(+)-Tartaric acid disodium saltAR，99%500克國產(chǎn)/進(jìn)口

L(-)酒石酸鈉/酒石酸鈉/L-酒石酸鈉/L-(+)-Tartaric acid disodium saltAR，99%500克國產(chǎn)/進(jìn)口

偏釩酸鈉/二水偏釩酸鈉/釩酸鈉/Sodium metavanadate dihydrateAR，99.9%，25克國產(chǎn)

無(wú)水偏釩酸鈉/釩酸鈉/Sodium metavanadateAR，99%，25克國產(chǎn)/進(jìn)口

四苯硼鈉/四苯基硼酸鈉/四苯硼酸鈉/NaTBPAR；99%，10克國產(chǎn)/進(jìn)口

氟化鈉/Sodium fluorideGR，99%，500克國產(chǎn)

氫氧化鈉/苛性鈉/燒堿/鈉氧條/苛性曹達/固堿/火堿/Sodium hydroxideGR，97%，500克國產(chǎn)

氟硼酸鈉/四氟硼鈉/四氟硼酸鈉/Sodium fluoroborateCP，98%，500克國產(chǎn)

六偏磷酸鈉/偏磷酸六鈉/格來(lái)漢氏鹽/卡甘/磷酸鈉玻璃/格臘哈姆鹽/六偏/六聚偏磷酸鈉/Sodium hexametaphoshpateCP，95%500克國產(chǎn)/進(jìn)口

萘酚AS-MX磷酸鹽/色酚AS-MX磷酸鹽/磷酸萘酚AS-MX/Naphthol AS-MX phosphate高純，99%500毫克國產(chǎn)/進(jìn)口

萘酚AS-BI磷酸二鈉/萘酚磷酸鈉/7-溴-N-(2-甲氧基苯基)-3-(磷酸氧基)萘-2-甲酰胺二鈉鹽/Naphthol AS-BI phosphate disodium saltBR，99.5%100毫克國產(chǎn)/進(jìn)口

單硬脂酸甘油酯/硬脂酸甘油酯/單甘酯/甘油單硬酯酸酯/十八酸甘油酯/GMSCP100克國產(chǎn)/進(jìn)口

丁二酸二甲酯/琥珀酸二甲酯/琥珀酸甲酯/Dimethyl succinateCP，98%100毫升國產(chǎn)/進(jìn)口

乙酰乙酸甲酯/乙酰醋酸甲酯/丁酮酸甲酯/β-丁酮酸甲酯/3-丁酮酸甲酯/MAACP，98%500毫升國產(chǎn)/進(jìn)口

對羥基苯甲酸甲酯/尼泊金甲酯/4-羥基苯甲酸甲酯/對羥基安息香酸甲酯/泊金M/尼泊金/Methyl 4-hydroxybenzoateCP，98.5%100克國產(chǎn)/進(jìn)口