技術(shù)文章/ARTICLES

   其原理是根據(jù)細(xì)胞因子特定的生物學(xué)活性，應(yīng)用相應(yīng)的指示系統(tǒng)，如各種依賴性細(xì)胞株或靶細(xì)胞，同時與標(biāo)準(zhǔn)品對比測定，從而得知樣品中細(xì)胞因子的活性水平，一般以活性單位(U／mL)表示。生物學(xué)活性檢測法所用的靶細(xì)胞可直接從組織中分離，如骨髓細(xì)胞的集落形成試驗和胸腺細(xì)胞(脾細(xì)胞)的增殖試驗，或用體外培養(yǎng)的依賴細(xì)胞因子才能生長的細(xì)胞因子依賴株及對細(xì)胞因子殺傷敏感的細(xì)胞作為靶細(xì)胞。其測定方法可分為促進(jìn)細(xì)胞增殖和增殖抑制法、抗病毒活性測定法、集落形成法、趨化作用測定法及細(xì)胞因子誘導(dǎo)產(chǎn)物測定法等。
   (1)促進(jìn)細(xì)胞增殖和增殖抑制法：目前已建立的應(yīng)用依賴細(xì)胞株檢測各種細(xì)胞因子的方法，其操作過程基本相同。檢測細(xì)胞因子促生長活性或抑制生長活性是將不同稀釋度的待測樣品或細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)品與培養(yǎng)的細(xì)胞株共同培養(yǎng)一定時間，然后檢測增殖的細(xì)胞數(shù)。前者的增殖細(xì)胞數(shù)與細(xì)胞因子的含量成正比，而后者的增殖細(xì)胞數(shù)與細(xì)胞因子的含量成反比。常用的檢測細(xì)胞增殖的方法有3H-TdR摻人法、比色法、染色法和直接計數(shù)法等。其中測定細(xì)胞代謝酶活性反映細(xì)胞增殖數(shù)量的比色法包括MTY、XTF、MTS和NAG等方法，可在酶標(biāo)儀上自動化檢測，且不接觸核素，較為常用。此外，測定代謝產(chǎn)物熒光強度的方法也可檢測增殖細(xì)胞數(shù)，如ATP法和cAMP法。細(xì)胞因子還能誘導(dǎo)靶細(xì)胞表達(dá)某些表面分子或分泌一些蛋白質(zhì)，可以用熒光素標(biāo)記抗體檢測表達(dá)相應(yīng)分子的細(xì)胞數(shù)，或用特定方法測定細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)，間接了解細(xì)胞因子的活性。
各種集落刺激因子(CSF)作用于造血系統(tǒng)的不同細(xì)胞，可促進(jìn)其增殖及在半固體瓊脂凝膠系統(tǒng)中克隆培養(yǎng)骨髓細(xì)胞的集落形成，故可采用集落形成試驗研究CSF的水平。
   (2)細(xì)胞毒活性測定法：許多細(xì)胞因子針對轉(zhuǎn)化的細(xì)胞及病毒感染的細(xì)胞具有溶細(xì)胞或抑制細(xì)胞生長的活性。檢測細(xì)胞因子溶細(xì)胞八田胞毒活性或抑制生長活性是將不同稀釋度的待測樣品或細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)品與培養(yǎng)的細(xì)胞株共同培養(yǎng)一定時間，然后檢測存活的靶細(xì)胞數(shù)，并與對照比較求得溶細(xì)胞或抑制細(xì)胞生長的百分率，或以O(shè)D值對樣品稀釋度作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)品的劑量反應(yīng)曲線，從曲線上求得相應(yīng)的待測樣品的含量。檢測活靶細(xì)胞數(shù)的方法同促細(xì)胞增殖法。
   (3)抗病毒活性測定法：檢測樣品中干擾素(1FN)的含量zui常用的方法是檢測其抗病毒活性，其檢測原理是用細(xì)胞因子樣品處理易感細(xì)胞，使細(xì)胞建立抗病毒狀態(tài)，然后用適量病毒攻擊細(xì)胞，評價病毒的復(fù)制量或病毒引起細(xì)胞病變被抑制的程度，即可判斷樣品中細(xì)胞因子的生物活性。常用于檢測IFN抗病毒活性的細(xì)胞株有WISH，Hep2/c，L929，A549，Ratec和MDBK等。其中WISH和Hep2/c細(xì)胞株用以檢測人干擾素，L929細(xì)胞株用于檢測小鼠干擾素，Ratec細(xì)胞株用于檢測大鼠于擾素，而MDBK細(xì)胞株則可用于檢測多種屬的IFN-a和IFN-Yo常用于攻擊細(xì)胞的病毒有濾泡性口炎病毒(VSV)、鼠腦心肌炎病毒(EMCV)以及Sindbisvirus等病毒。檢測抗病毒活性的具體方法包括測定細(xì)胞因子抑制病毒的致細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)、抑制病毒蝕斑形成或抑制病毒的產(chǎn)量等。IFN的抗病毒活性通常以每毫升樣品中所含的單位數(shù)(U／mL)表示，IFN的純度則以每毫克蛋白質(zhì)中所含的單位數(shù)(U/mg)或IFN的量(ug/mg)表示。IFN抗病毒活性單位的定義是指能抑制50％細(xì)胞病變或50％病毒空斑形成效應(yīng)的IFNzui高稀釋度的倒數(shù)。
    (4)趨化活性測定法：多種細(xì)胞因子具有趨化活性，分別能誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞等定向遷移。趨化因子誘導(dǎo)細(xì)胞移動的方式包括趨化性和化學(xué)增活現(xiàn)象。趨化性(chemotaxis)是指誘導(dǎo)細(xì)胞向趨化因子化學(xué)濃度高的方向作定向移動，可采用瓊脂糖和微孔小室趨化試驗測定細(xì)胞因子的趨化活性；化學(xué)增活現(xiàn)象(chemokinesis)是指增強細(xì)胞的隨機(jī)運動，可采用瓊脂糖小滴化學(xué)動力學(xué)試驗檢測。