技術(shù)文章/ARTICLES

    微小殘留病(minimal residual disease，MRD)一般是指白血病患者在經(jīng)過(guò)治療后體內(nèi)殘存白血病細(xì)胞的狀態(tài)，被認(rèn)為是白血病復(fù)發(fā)及影響預(yù)后的主要原因。廣義而言，此含義還可包括其他惡性腫瘤。MRD被認(rèn)為是在傳統(tǒng)檢測(cè)方法所能檢測(cè)到的腫瘤細(xì)胞水平以下的長(zhǎng)期存在的腫瘤細(xì)胞，這些腫瘤細(xì)胞一旦增殖到一定程度能引起復(fù)發(fā)。因此，有效利用MRD檢測(cè)能夠很好地指導(dǎo)治療以增加*，提高療效，特別是對(duì)HSCT的療效評(píng)估方面也有重要的意義。

 MRD的檢測(cè)方法

    MRD的檢測(cè)方法很多，主要有細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)、FISH、流式細(xì)胞儀和PCR等方法。各種檢測(cè)MRD方法應(yīng)用情況及其優(yōu)缺點(diǎn)的比較。

1.形態(tài)學(xué)方法

    常用方法包括骨髓穿刺和骨髓活檢。常規(guī)骨髓穿刺涂片檢查法對(duì)臨床白血病的診斷、療效觀察、復(fù)發(fā)判斷仍具有很重要的作用，但形態(tài)學(xué)上尚不能真正區(qū)分正常細(xì)胞與白血病細(xì)胞，只是依據(jù)原始細(xì)胞百分比進(jìn)行判斷。即使在實(shí)體瘤患者中，通過(guò)組織細(xì)胞學(xué)檢測(cè)仍不能敏感地反映腫瘤細(xì)胞的存在情況。而孤立的腫瘤細(xì)胞極易進(jìn)入靜止期而不易被檢測(cè)到。實(shí)體瘤或急性白血病患者的類似孤立的細(xì)胞可通過(guò)多部位采集涂片檢查而增加陽(yáng)性檢出率，但zui終還需要更敏感、更客觀的檢測(cè)手段來(lái)證實(shí)。

    白血病*緩解后骨髓活檢檢查 MRD預(yù)測(cè)判斷復(fù)發(fā)要比穿刺涂片更敏感些，尤其是切片上發(fā)現(xiàn)呈斑點(diǎn)狀的原始細(xì)胞，應(yīng)高度懷疑白血病復(fù)發(fā)的可能?？傊?，骨髓形態(tài)學(xué)方法對(duì)于檢查MRD一般來(lái)說(shuō)不夠敏感，只有當(dāng)體內(nèi)白血病細(xì)胞>109時(shí)才有意義。但是細(xì)胞形態(tài)學(xué)方法仍為判斷白血病狀態(tài)的重要方法。

2.體外熒光原位雜交技術(shù)

    對(duì)于血液腫瘤中非隨機(jī)的細(xì)胞遺傳學(xué)的認(rèn)識(shí)，促進(jìn)了對(duì)疾病病原學(xué)的認(rèn)識(shí)。新的異常染色體的發(fā)現(xiàn)有利于促進(jìn)白血病的分類，特別是某些染色體的異?？勺鳛榕袛囝A(yù)后的重要指標(biāo)。

    傳統(tǒng)的細(xì)胞遺傳學(xué)分析的敏感性受處于分裂中期的染色體的數(shù)量所限制，而且很少應(yīng)用于MRD的研究上。與白血病相關(guān)的細(xì)胞遺傳學(xué)改變可預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)，而無(wú)類似的改變也不能排除復(fù)發(fā)。因此，傳統(tǒng)的細(xì)胞遺傳學(xué)的分析耗時(shí)、費(fèi)力，且對(duì)檢測(cè)者水平要求比較高。

    FISH是一種較傳統(tǒng)細(xì)胞遺傳學(xué)更為特異、敏感、方便的方法。它是指在細(xì)胞內(nèi)用熒光標(biāo)記的DNA探針與染色體雜交，它可用分裂期的細(xì)胞作為研究對(duì)象，包括中期FISH和間期FISH，二者均可用于分析異常染色體的數(shù)量和結(jié)構(gòu)，而間期FISH不需要培養(yǎng)細(xì)胞，可同時(shí)進(jìn)行免疫分型和基因分型，更多地應(yīng)用于分析具有細(xì)胞遺傳學(xué)異常的細(xì)胞的比例。

    FISH可應(yīng)用于以下情況:①獲取或丟失整條染色體或腫瘤特異染色體區(qū)域;②檢測(cè)單基因的缺失和重排;③定義一些用傳統(tǒng)細(xì)胞遺傳學(xué)方法無(wú)法明確的染色體異位;④揭示一些特殊的、異常的復(fù)雜核型;⑤評(píng)估致癌基因或腫瘤超基因的拷貝數(shù);⑥監(jiān)測(cè)患者的臨床過(guò)程，如性別不合的HSCT。

3.流式細(xì)胞儀

    流式細(xì)胞儀(flow cytometer，F(xiàn)CM)是一種對(duì)處在液流中的細(xì)胞或其他生物微粒逐個(gè)進(jìn)行多參數(shù)的快速定量分析和分選的技術(shù)。FCM可同時(shí)分析多種細(xì)胞參數(shù)(如細(xì)胞形態(tài)、活力和免疫表型)，還能用熒光位點(diǎn)雜交來(lái)進(jìn)行 MRD的研究。因此，流式細(xì)胞儀作為當(dāng)前的研究MRD的儀器，是因?yàn)樗芡瑫r(shí)區(qū)分多熒光染料，從而使MRD檢測(cè)更加方便和更為有效。

    FCM對(duì)MRD檢測(cè)的敏感性取決于所要檢測(cè)的細(xì)胞數(shù)量及目標(biāo)細(xì)胞與非目標(biāo)細(xì)胞在形態(tài)上和表型上的區(qū)別程度。在理想條件下，大于1/107個(gè)細(xì)胞的目標(biāo)細(xì)胞可用流式細(xì)胞儀檢測(cè)到，而1/106的目標(biāo)細(xì)胞能清楚地被檢測(cè)到。當(dāng) MRD被用于臨床時(shí)，不同標(biāo)記的目標(biāo)細(xì)胞的數(shù)量較低，10～20個(gè)集落細(xì)胞可用于解釋流式的信號(hào)，從而使MRD的敏感性增加到1/104。

4.聚合酶鏈反應(yīng)

    聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain eraction，PCR)是一種在體外擴(kuò)增DNA片段的重要技術(shù)。當(dāng)存在模板DNA、底物、上下游引物和耐熱的DNA聚合酶時(shí)，經(jīng)過(guò)多次“變性—復(fù)性—延伸反應(yīng)”的循環(huán)過(guò)程;痕量模板DNA可擴(kuò)增至幾百萬(wàn)倍。因此用PCR進(jìn)行MRD檢測(cè)是極為合適的，并使 MRD的檢測(cè)方法有了突破性的進(jìn)展?，F(xiàn)有的PCR方法包括RNA-PCR、反向PCR、引物標(biāo)記PCR、實(shí)時(shí)PCR(RT-PCR)和實(shí)時(shí)定量PCR(RQ-PCR)。

    PCR方法擴(kuò)增的腫瘤特異核苷酸序列包括染色體易位的斷裂點(diǎn)結(jié)合區(qū)、患者特異的抗原受體基因重排序列和異常表達(dá)的基因。PCR檢測(cè)MRD的敏感度已達(dá)到1/107～1/106，使MRD的檢出率大大提高，這種方法是目前臨床研究 MRD的主要手段之一。PCRzui大的限制是污染影響了其敏感性。預(yù)防污染發(fā)生就要防止由于污染而導(dǎo)致的假陽(yáng)性，特別是由于一些特殊擴(kuò)增物質(zhì)延續(xù)而產(chǎn)生的結(jié)果。