技術(shù)文章/ARTICLES

(一)原理

    Northern雜交(Northern blotting)是利用DNA可以與RNA進行分子雜交來檢測特異性RNA的技術(shù)，首先將RNA混合物按它們的大小和分子量通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離，分離出來的RNA轉(zhuǎn)至尼龍膜或硝酸纖維素膜上，再與放射性標(biāo)記的探針雜交，通過雜交結(jié)果可以對表達量進行定性或定量。

    Northern雜交是用來測量真核生物RNA的量和大小估計其豐度的實驗方法，可以從大量的RNA樣本同時獲得這些信息。其基本步驟包括：①完整mRNA的分離；②根據(jù)RNA的大小通過瓊脂糖凝膠電泳對RNA進行分離；③將RNA轉(zhuǎn)移到固相支持物上，在轉(zhuǎn)移的過程中，要保持RNA在凝膠中的相對分布；④將RNA固定到支持物上；⑤固相RNA與探針分子雜交；⑥除去非特異結(jié)合到固相支持物上的探針分子；⑦對特異結(jié)合的探針分子的圖像進行檢測、捕獲和分析。ELISA試劑盒

(二)材料

1．待檢測的RNA及制備好的探針。

2．試劑DEPC、瓊脂糖(電泳級)、MOPS電泳緩沖液(10×和l×)、37％甲醛溶液(pH>4)、甲酰胺、甲醛加樣緩沖液、SSC(10×、20×、l×、0．25×)、10mg／ml溴化乙啶、Northern雜交溶液、N0rthern雜交溶液、O．1％SDS DEPC處理的雙蒸水。

3．儀器及器材60℃水浴箱、平臺式搖床、硝酸纖維素膜、濾紙、雜交袋、電泳裝置和放射自顯影所需試劑和設(shè)備。

(三)方法

1．凝膠或甲醛凝膠的準(zhǔn)備

(1)配制1．2％瓊脂糖凝膠：將4．2g瓊脂糖加入304．5ml水中(用500ml角燒瓶)，放入微波爐內(nèi)溶化后，置于60℃水浴中(凝膠量應(yīng)根據(jù)所需制備的凝膠板大小來決定，一般是20cm×20cm的凝膠板)。

(2)當(dāng)瓊脂糖凝膠涼至60℃時，加入35ml 10×MOPS電泳緩沖液，并加入10．5ml37％甲醛溶液，充分混勻。

(3)準(zhǔn)備好電泳槽，并將加樣孔成形梳插入，使梳頂端與槽底約有1mm距離，倒入上述甲醛瓊脂糖凝膠溶液，冷卻30～45min，小心抽出梳子，加人1×MOPS電泳緩沖液，淹沒凝膠表面(加樣孔大小約10 mm×lmm，以便能加入約60ul樣品)。ELISA試劑盒

2．RNA電泳及轉(zhuǎn)移

(1)混合液的配制：用5p110×MOPS電泳緩沖液、8．755μl37％甲醛、25μl甲酰胺。

(2)將RNA樣品加入混合液中，zui后加水至50μl，每種RNA樣品做一重復(fù)對照：一種RNA樣品的用量為O．5～1．Oμl，如果待測的RNA在總RNA中含量較高，可以直接用總RNA為樣品(如<0．05％)，否則用Poly(A)+RNA代替。

(3)充分混勻樣品，離心5～10s，在55℃中溫育15min。

(4)每種樣品加入10μl甲醛加樣緩沖液，混勻并離心，立即加樣。

(5)5V／cm電泳3h，待二甲苯藍指示劑泳動到凝膠的一半距離時結(jié)束電泳。

(6)將完成電泳后的凝膠直接轉(zhuǎn)移到一大盤內(nèi)，用DEPC理的雙蒸水漂洗數(shù)次，以除去甲醛(轉(zhuǎn)移用RNA凝膠不用EB染色，而重復(fù)對照組可用EB染色，并與標(biāo)準(zhǔn)RNA的分子量對照)。

(7)倒出漂洗液，加入500ml 10×SSC盤中，將盤置于平臺式搖床上輕搖45min。

(8)將凝膠塊置于塑料膠片上，測量膠塊的長與寬，然后再將膠塊放人lO×SSC中。

(9)剪下比膠塊約小3mm的一塊硝酸纖維素膜，將硝酸纖維素膜在盤中浸濕約1min，
然后再將膜放入20×SSC中5～10min。操作時應(yīng)戴手套，防止手上的油脂污染膜面。

(10)將凝膠塊左下角切去，以便定位。準(zhǔn)備一玻璃平臺，置于一裝有20×SSC的大盤之中，在平臺上鋪上一層濾紙(Whatman 3mm濾紙)，此紙要比膠塊寬約2cm、長30～40cm，使紙兩端浸入臺下的20×SSC之中，排除濾紙與玻璃板之間的氣泡。

(11)從lO×SSC中輕輕移出凝膠塊，瀝干表面水分，并將其平鋪在玻璃平臺的濾紙上(注意，不要在凝膠與濾紙之間形成氣泡)。將硝酸纖維素膜從20×SSC中取出，平鋪在膠塊的表面，剪去左下角(注意：硝酸纖維素膜的面積不要大于膠塊，也不能在膜與膠塊之間形成氣泡)。

(12)將準(zhǔn)備好的吸水濾紙2～3張放入20×SSC中浸濕，然后置于吸水紙上，吸干多余水分，將其鋪在硝酸纖維素膜上(注意：這一疊紙的面積不能超過下面硝酸纖維素膜，四周留出2～3mm，紙與膜之間不能存在氣泡)。

(13)在*層吸水紙之上，放上比層析紙稍小的一疊吸水紙(5～8cm厚)，再存吸水紙上加一塊玻璃板，其上可以壓上約500g的重物。轉(zhuǎn)移液在吸水紙的虹吸作用下從容器中轉(zhuǎn)移到吸水紙上，從而帶動凝膠中小的RNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。

(14)用保鮮膜將盛有轉(zhuǎn)移液的盤于蓋上，減少蒸發(fā)作用。需要保持轉(zhuǎn)移時間6～24h，其問更換吸水紙1～2次。

(15)用鑷子除去層析紙，將硝酸纖維素膜置于一張干燥濾紙上，用記號筆標(biāo)明加樣孔的位置。

(16)硝酸纖維素膜用6M×SSC浸泡5min，以去掉瓊脂糖塊。

(17)干燥硝酸纖維素膜，將其置于兩層干燥濾紙之間，70～80℃烘干下2h。

(18)此硝酸纖維素膜可以用于下一步雜交反應(yīng)，也可用鋁箔包好，室溫下真空中保存?zhèn)溆谩?/p>

3．預(yù)雜交、雜交和洗膜

(1)將烘干的硝酸纖維素膜放人一個可以封口的雜交袋內(nèi)，加入6～10ml Northern預(yù)雜交溶液(量的多少根據(jù)纖維素膜的大小而定)。封閉雜交袋(預(yù)雜交液應(yīng)加入袋底層，排除其中氣泡，用封口機將袋口封牢)。前后搖動袋子數(shù)次，以使硝酸纖維素膜充分濕潤。

(2)于37～42℃恒溫水浴箱中，保溫過程中不時將雜交袋搖動數(shù)次。

(3)將準(zhǔn)備好的放射性或非放射性標(biāo)記探針置入6～10ml Northern雜交液中，取此液6～10ml，煮沸探針5min，然后加入Northern雜交液混勻。

(4)將雜交袋剪開一個小口，倒出預(yù)雜交液，將袋放在一平面臺上，用10 ml加樣器頭輕擠壓一下。

(5)加入雜交液與探針混合液，使之在膜上分布均勻，然后再次排出氣泡，密封袋口。為防止放射性污染，可以在袋外再加套一個保護袋。

(6)置于37～42℃恒溫水浴箱中。ELISA試劑盒

(7)次日剪開袋口，取出硝酸纖維素膜，洗膜。方法如下：用1×SSC加入O．1％SDS，室溫下洗2次，每次15min，然后再加入O．25×SSC(含O．1％SDS)，室溫下洗2次，每次15min。

(8)在室溫下．硝酸纖維素膜用O．1×SSC稍稍漂洗，用層析紙吸去硝酸纖維素膜上多余水分。進行放射自顯影．一般經(jīng)過24h后可在x線膠片上顯現(xiàn)RNA條帶。如系非放射性標(biāo)記探針，可用酶或熒光染色分析。