技術(shù)文章/ARTICLES

    細(xì)胞遺傳學(xué)毒性檢測主要是在分子水平檢測毒性物質(zhì)對細(xì)胞遺傳性的影響；在遺傳性疾病的分子診斷和致病機(jī)制研究中，已得到廣泛應(yīng)用。常用的檢測技術(shù)包括染色體畸變分析、微核試驗(yàn)、基因突變和DNA斷裂檢測等。

*節(jié)染色體標(biāo)本制備

    染色體是在顯微鏡下可見的細(xì)胞有絲分裂過程中出現(xiàn)的結(jié)構(gòu)。對染色體檢查分析之前，需要進(jìn)行染色體標(biāo)本制備。通常情況下，都是利用外周血淋巴細(xì)胞進(jìn)行染色體核型分析。正常情況下．人體外周血淋巴細(xì)胞不再分裂，但植物血凝素(phytohemagglutinin，PHA)可刺激血中的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化成淋巴母細(xì)胞，使其恢復(fù)增殖能力。因此，可采取少量外周靜血，做短期培養(yǎng)，刺激增殖后進(jìn)入增殖旺盛期，此時加入秋水仙素抑制細(xì)胞分裂，使細(xì)胞分裂停止在中期以獲得足夠量的分裂期細(xì)胞，經(jīng)低滲、固定、制片、染色后鏡下觀察進(jìn)行核型分析。上述制備的染色體標(biāo)本經(jīng)胰蛋白酶消化、Giemsa染色后，可在染色體縱軸上顯示出著色深、淺相間的橫紋條帶，表明每條染色體的特征。

一、材料與方法

(一)實(shí)驗(yàn)材料

1．受試材料人外周血。

2．淋巴細(xì)胞分層液 比重為1．077±O．OOl。如Ficoll Hypaque分層液、Percoll—Paque分層液。

3．RPMll640培養(yǎng)液，含20％小牛血清。

4．促細(xì)胞分裂劑植物血凝素(PHA)。

5．秋水仙堿(20μg／m1)。

6．75 mmol／LMgCl2。

7．固定液(甲醇：冰醋酸=3：1)。

8．Macllvaine’s緩沖液(pH 6．0)。

9．奎吖因(QM)染液(50μg／ml)。

10．O.85％生理鹽水。

11．0．25％胰酶(pH7．2)。

12．Glemsa染液。

13．O．2mol／LHCl。

14．5％Ba(OH)2 。

15．2×SSc．

16．磷酸緩沖液(pH 7．2)。

(二)實(shí)驗(yàn)方法

1．人外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)

(1)根據(jù)需要收集全血，加入肝素溶液(O．2ml肝素／10ml全血)抗凝。

(2)用PBS液將抗凝血稀釋一倍，輕輕混勻。

(3)將淋巴細(xì)胞分層液加于離心管底部，小心操作，盡量避免碰到管壁。

(4)再用毛細(xì)管將稀釋的血液沿管壁輕輕加到分層液上面，小心操作，不要將血液沖人分層液中。

(5)20OOr／min離心20min。離心后輕輕取出離心管，不要破壞分層(圖5—2)。可見從上至下分成4層：*層為稀釋的血漿；第二層為白膜層，主要含淋巴細(xì)胞，還混有少量血小板；第三層為分層液；第四層為粒細(xì)胞和紅細(xì)胞層，紅細(xì)胞沉于管底，粒細(xì)胞是緊貼在紅細(xì)胞層上面的一層薄薄的白膜。

(6)用注射器或吸管沿試管壁吸出中間的白膜層(吸時用鈍圓針頭或吸管，而不要用尖的頭吸)，加入到另外的離心管中。

(7)用5倍以上體積的PBS液洗細(xì)胞，1500r／min離心10min，快速吸出上清液。

(8)再用PBS液洗滌2次，zui后一次洗滌后，細(xì)胞沉淀重懸于5ml培養(yǎng)液中，細(xì)胞計(jì)數(shù)。

(9)用RPMll640培養(yǎng)液將細(xì)胞配成所需密度，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中加促細(xì)胞分裂劑。

(10)終止培養(yǎng)前2～3h，加入濃度為20 μg／ml的秋水仙素，終濃度為O．1μg／ml。輕輕搖勻后，再放入恒溫箱內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)2～3h，以積累較多停止在分裂中期的細(xì)胞。

2．制片

(1)收獲細(xì)胞：取出培養(yǎng)瓶，將培養(yǎng)液搖勻后傾入10ml刻度離心管中，1000 r／min離心8～10rnin，吸棄上清液，保留細(xì)胞懸液約O．5ml。

(2)低滲處理：向離心管中加入6ml已溫浴達(dá)37℃75mmol／L的KCl溶液，用吸管混勻，置37℃恒溫水浴箱中低滲25～30min(的低滲時間可自行摸索)。

(3)預(yù)固定：低滲處理完成后，加入1ml新配制的固定液并用吸管混勻，1000 r／min離心8～10min。吸棄上清液。

(4)固定：加入8ml固定液，用吸管將沉淀的細(xì)胞輕輕混合成細(xì)胞懸液，室溫下靜置如min后，1000 r／min離心8～10min。吸棄上清液。

(5)再固定：加入8m1固定液，用吸管輕輕吹打使細(xì)胞混勻，室溫下靜止15min或更長時間。(若不立即制片，可將離心管口蓋好，置冰箱中或更長時間)。

(6)制片：將上述細(xì)胞混懸液1000 r／min離心8～10min，吸棄上清液，視離心管中沉淀(細(xì)胞)的多少加入O．2～O．4ml左右的固定液，用吸管輕輕混成細(xì)胞懸液(混合后的液體呈淡乳白色即表示細(xì)胞濃度適當(dāng))。用吸管吸取細(xì)胞懸液盡量高距離地的滴于清潔預(yù)冷的玻片上，每片滴1～2滴，靜置并在空氣中晾干，也可在酒精燈火焰上略加烘烤。

(7)在玻片制成的一周內(nèi)進(jìn)行染色體顯帶。

3．染色體顯帶一QM熒光染色法

(1)常規(guī)制備染色體標(biāo)本，要求背景清晰無核質(zhì)覆蓋。

(2)浸入pH6．o的Macllvaine’s緩沖液內(nèi)幾秒鐘。

(3)標(biāo)本放入50μg／ml QM溶液中，染色20min

(4)用Macllvalne’s緩沖液(或蒸餾水)沖洗3次，每次2min。

(5)滴數(shù)滴緩沖液于標(biāo)本上，覆蓋以大蓋玻片。

(6)置熒光顯微鏡下觀察。

4．染色體顯帶G顯帶染色法

(1)常規(guī)制作染色體標(biāo)本，置37℃恒溫箱內(nèi)72h。于實(shí)驗(yàn)前6h置60℃烘箱中預(yù)處理6h。

(2)將O．85％生理鹽水50ml置37℃水浴鍋內(nèi)預(yù)溫至(37±O．5)℃；將O．25％胰酶溶液用O．85％生理鹽水稀釋，終濃度為O．05％，預(yù)溫至(37±O．5)℃。

(3)將玻片投入胰酶溶液中不停擺動1 5～17s。

(4)取出玻片，立即用l：10 Giemsa染液(pH7．2磷酸緩沖液配制)染色lO～20min。

(5)自來水輕輕沖洗，空氣晾干，鏡檢。

5．染色體顯帶c顯帶染色法

(1)按常規(guī)法制備染色體標(biāo)本，片齡不超過3d。

(2)用O．2 mol／L HCl溶液在室溫下處理15～30 min，以除去組蛋白和非組蛋白。

(3)自來水沖洗后，再用蒸餾水沖洗數(shù)秒。

(4)將標(biāo)本浸于預(yù)溫到55～65℃5％Ba(0H)2水溶液中15～20min。

(5)立即用自來水沖洗．去掉污垢，再用蒸餾水沖洗片刻。

(6)將標(biāo)本置于預(yù)溫的55℃2×SS(：溶液中55℃處理l～1．5h。

(7)用蒸餾水沖洗數(shù)秒。

(8)用l：10 Giemsa染液染色20～30min。

(9)自來水沖洗，空氣干燥，鏡檢。

二、結(jié)果分析

根據(jù)染色體的形態(tài)、大小及著絲粒的位置，將染色體分為七組。

A組染色體：包括1～3號染色體。長度zui長，1號和3號染色體為中央著絲粒，2號染色體為亞中央著絲粒染色體。

B組染色體：包括4～5號染色體，長度次于A組；亞中央著絲粒染色體，短臂較短。

c組染色體：包括6～12號和x染色體，中等長度，亞中央著絲粒染色體。

D組染色體：包括13～15號染色體，具有近端著絲粒和隨體。

E組染色體：包括16～18號染色體，16號染色體著絲粒在3／8處，17號和18號染色體著絲粒約在1／4處。

F組染色體：包括19號和20號染色體，中央著絲粒。

G組染色體：包括21號、22號和Y染色體，是染色體組中zui小的，為近端著絲粒的染色體。21號和22號染色體具有隨體。

三、注意事項(xiàng)

(一)接種的血樣要新鮮，如不立即培養(yǎng)，應(yīng)放在4～25℃，于24h內(nèi)培養(yǎng)。

(二)培養(yǎng)箱溫度以(37±O．5℃)為宜。

(三)培養(yǎng)過程中如發(fā)現(xiàn)血樣凝集，可將培養(yǎng)瓶輕輕震蕩，使凝塊散開，然后繼續(xù)培養(yǎng)。

(四)離心速度過快，細(xì)胞團(tuán)不易打散，速度過低，則使分裂象細(xì)胞大量丟失。

(五)玻片要嚴(yán)格清潔，使細(xì)胞均勻鋪開。